蛋白质含量是人血白蛋白质量评价的重要指 标。不确定度是与测量结果相关联的参数,表征合 理地赋予被测量值的分散性。本文对凯氏定氮法测 定人血白蛋白中蛋白质含量的不确定度来源和大小 进行分析和评价,并初步探讨在运用该方法的过程 中应注意的问题,旨在为人血白蛋白以及食品( 尤 其是乳制品) 中的蛋白质含量测定提供一定参考。 　实验材料及条件

1. 1　仪器及试药 仪器: 自动定氮仪(Ge r h a r d tVa p o de s t 30 Di g e s t S y s t e m); 玻璃仪器( 1、2、10 mL移液管; 20、100 mL 容量瓶; 25 mL酸式滴定管) , 20 ℃下校准。
试药: 人血白蛋白( 贵阳黔峰生物制品有限公 司生产,批号为 20070830,规格为 20%, 10 g); 0. 005 mo l ·L -1硫酸滴定液 ( 本所化学室标定 ); 10%钨酸钠溶液; 0. 33 mo l ·L -1 硫酸溶液; 2%硼酸 溶液; 40%氢氧化钠溶液; 甲基红溴甲酚绿混合指 示液; 98%硫酸; 无水硫酸钠; 硫酸铜。

1. 2　实验室环境 温度变化范围: ( 20±4)℃。 　

方法

2. 1　试验过程 按照中国药典 2005年版三部[ 1 ] 的规定,测定人 血白蛋白中的蛋白质含量,过程见图 1。2. 2　建立数学模型 人血白蛋白中蛋白质含量 W的计算公式为:
W(%)=C PN×6. 25×1/10×1/20×r e p×100% 其中, C P N=C TN– C NPN

C T N=(V T 4– V 0) ×(V T 1 / V T 2) ×0. 140 1 ×C D/0. 005 × (V D 1 /V D 2)/V T 3 C NPN=(V N4– V 0)×(V N1/ V N 2)×0. 140 1 ×C D/0. 005 × (V D1/ V D2) / V N 3 r e p为总重复性因子。 以 y 表示 W , x i 表示第 i 个影响参数,得 y的合 成标准不确定度为: u c(y )= ∑ n i =1c 2 iu 2(x i )= ∑∑ n i=1u 2(y , x i ) 其中 c i 为灵敏系数,记为偏导 y / x ;u (y , x i) 为由 x i 不确 定度引起的 y的不确定度。 　不确定度的来源及分析

3. 1　不确定度的来源 从人血白蛋白中蛋白质含量测定流程图来看,凯 氏定氮法测定蛋白含量的不确定度主要来源于 9个 方面: 1) 试验重复性; 2) 标定硫酸滴定液浓度; 3) 稀释 硫酸滴定液; 4) 测定总氮稀释样品; 5) 滴定总氮吸取 样品; 6) 滴定总氮实际消耗硫酸滴定液的体积; 7) 测 定非蛋白氮稀释样品; 8) 滴定非蛋白氮吸取样品; 9) 滴定非蛋白氮实际消耗硫酸滴定液的体积。

3. 2　不确定度 u (x i) 的量化分析

3. 2. 1　由试验重复性引入的标准不确定度 u (r e p ) 按药典标准对人血白蛋白样品平行测定 6次,结 果见表 1。 定规程》查得, A级 10. 0 mL移液管和 A级 100 mL 容量瓶的允许偏差分别为 ±0. 02和 ±0. 10 mL [2] , 近似于三角形分布 [ 3] , 换算成校准不确定度分别 为: 0. 02/60. 5 =0. 008 2 mL , 0. 10/60. 5 =0. 041 mL 。 该容量瓶和移液管均在 20 ℃校准。本实验室温 度变化范围为( 20 ± 4)℃,近似于矩形分布。水的膨 胀系数为 2. 1 × 10 4。换算成温度不确定度分别为: ( 10. 0×2. 1×10-4 ×4)/30.5 =0. 0048 mL ( 100×2. 1×10-4 ×4) /30. 5 =0. 048 mL 由上述不确定度分量合成得: u(V D1)=( 0. 008 22 +0. 004 82) 0. 5 =0. 009 5 mL u(V D2)=( 0. 0412 +0. 048 2) 0. 5 =0. 064 mL u(V D1/ V D 2)= [( 0. 009 5/10. 0) 2 +( 0. 064/100) 2] 0. 5 ×0. 1 =0. 000 11

3. 2. 4　测定总氮稀释样品(V T 1 /V T 2) 引入的不确定 度 u(V T 1/ V T 2) 由《常用玻璃量器检定规程》可知, A级 1. 0 mL 移液管和 A级 20 mL容量瓶的允许偏差分别为 ±0. 007和 ±0. 02 mL [ 2] ,近似于三角形分布[ 3] ,换 算成校准不确定度分别为: 0. 007/60. 5 =0. 0029 mL 0. 02/60. 5 =0. 008 2 mL 换算成温度不确定度分别为: 1. 0×2. 1×10-4 ×4/3 0. 5 =0. 000 48 mL 20×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 0097 mL 由上述不确定度分量合成得: u(V T 1)=( 0. 00292 +0. 00048 2) 0. 5 =0. 002 9mL u(V T 2)=( 0. 00822 +0. 00972) 0. 5 =0. 0127 mL u(V T 1 /V T 2)= [( 0. 002 9/1. 0) 2 +( 0. 012 7/20) 2] 0.5 ×0. 05 =0. 000 15

3. 2. 5　滴定总氮吸取样品( V T 3) 引入的不确定度 u ( V T 3) 与“3. 2. 4”项相同, A级 1. 0 mL移液管的的校准 不确定度为 0. 0029 mL ,温度不确定度为0. 00048 mL 。 由上述不确定度分量合成得: u(V T 3)=( 0. 00292 +0. 00048 2) 0. 5 =0. 002 9mL

3. 2. 6　滴定总氮实际消耗硫酸滴定液的体积 (V T 4 -V 0) 引入的不确定度 u(V T 4 -V 0) 1) 肉眼判断终点所引入的不确定度已包含在 测量重复性引入的标准不确定度 u (r e p ) 中,此处不 再考虑; 2) 滴定管引入的标准不确定度: 由《常用玻 璃量器检定规程》可知, 25. 0 mL的 A级滴定管其最 大容量的允许偏差为 ±0. 04 mL [2] ,近似于三角形 分布[ 3] ,换算成校准不确度为:0. 04/60. 5 =0. 0164 mL V T 4 =12. 36 mL V 0 =0. 35 mL 温度不确定度分别为: 12. 36×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 006 0 mL 0. 35×2. 1×10 -4 ×4/30. 5 =0. 000 2mL 上述标准不确定度分量合成得: u (V T 4)=( 0. 016 42 +0. 006 02) 0.5 =0. 0175 mL u (V 0)=( 0. 016 42 +0. 000 22) 0. 5 =0. 016 4 mL u (V T 4 -V 0)=( 0. 017 52 +0. 01642) 0.5 =0. 0240 mL

3. 2. 7　测定非蛋白氮稀释样品(V N 1 / V N 2 ) 引入的 不确定度 u(V N 1 / V N 2) 由《常用玻璃量器检定规程》可知, A级 2. 0 mL 移液管和 A级 20 mL容量瓶的允许偏差分别为 ±0. 010和 ±0. 02 mL [ 2 ] ,近似于三角形分布[3] ,换 算成校准不确定度分别为: 0. 010/60. 5 =0. 004 1 mL 0. 02/60. 5 =0. 0082 mL 温度不确定度分别为: 2. 0×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 00097mL 20×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 009 7 mL 由上述不确定度分量合成得: u (V N 1)=( 0. 00412 +0. 000972) 0.5 =0. 0042 mL; u (V N 2)=( 0. 00822 +0. 00972) 0. 5 =0. 0127 mL; u (V N 1 /V N2)= [ ( 0. 0042/2. 0) 2 +( 0. 0127/20) 2] 0. 5 ×0. 1= 0. 000 22

3. 2. 8　滴定非蛋白氮吸取样品(V N 3) 引入的不确定 度 u (V N 3) u (V N3) 即由 5. 0 mL移液管引入的不确定度。 由《常用玻璃量器检定规程》可知, A级 5. 0 mL移 液管的允许偏差为 ±0. 015 mL [ 2] ,近似于三角形分 布[ 3] ,换算成校准不确定度为: 0. 015/60. 5 =0. 006 2 mL温度不确定度为:
5. 0×2. 1×10-4 ×4/3 0. 5 =0. 002 4mL 由上述不确定度分量合成得: u(V N3)=( 0. 006 22 +0. 002 42) 0. 5 =0. 006 6 mL

3. 2. 9　滴定非蛋白氮实际消耗硫酸滴定液的体积 (V N 4 -V 0) 引入的不确定度 u (V N 4 -V 0) 1) 肉眼判断终点所引入的不确定度已被包含 在测量重复性引入的标准不确定度 u(r e p) 中,在此 处不再考虑。2) 滴定管引入的标准不确定度: 查标 准得 25. 0 mL的 A级滴定管其最大容量的允许偏 差为 ±0. 04 mL [ 2 ] ,近似于三角形分布[ 3 ] ,换算成校 准不确度为: 0. 04/60. 5 =0. 016 4 mL V N 4 =6. 15 mL V 0 =0. 35mL 温度不确定度分别为: 6. 15×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 003 0 mL 0. 35×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 000 2 mL 上述标准不确定度分量合成得: u(V N4)=( 0. 016 42 +0. 003 02) 0. 5 =0. 016 7 mL u(V 0)=( 0. 01642 +0. 00022) 0. 5 =0. 0164 mL u(V N 4 -V 0)=( 0. 016 72 +0. 01642) 0. 5 =0. 023 4mL

3. 3　不确定分量及各分量分析 在不确定度表达式中,假如 y(x 1, x 2, …, x i) 对 x i 是线性或与 x i 相比其 u (x i) 较小,偏导( y / x ) 可 近似为: y / x ≈{y [ x i+u(x i) ] -y(x i )} /u (x i ) 将 u (x i) 计入,获得因 x i 不确定度引起的 y的不 确定度 u(y , x i) [ 4] ,即: u(y , x i)≈y {x 1, x 2…[x i+u (x i ) ]…x n}-y (x 1, x 2, …, x i , …, x n) 根据上式,由各不确定分量 u( x i) 进行计算可得到 对应的 u ( y , x i) ,结果见表 2。

3. 4　合成标准不确定度及扩展不确定度的计算 根据表 2结果,可得合成标准不确定度(u c) 为: u c= ∑ n i=1 u 2(y , x i )=0. 62% 扩展不确定度(U) 的计算公式为: U=k ·u c 置信因子(k ) 取 2,即置信概率为 95%,可得: U=0. 62% ×2=1. 2% 故人血白蛋白中蛋白质含量 W(%) 可表示为 ( 104. 7±1. 2)%。 　

讨论
根据小分量不确定度不足最大分量不确定度的 1/3时,小分量不确定度可以忽略不计的原则[ 4] ,由 以上的评定结果可看出,本方法测定结果的不确度 主要来源于 6个分量: 测定总氮稀释样品的不确定 度 u(V T 1/ V T 2 ) 、滴定总氮吸取样品的不确定度 u (V T 3) 、测量重复性 u(r e p) 、标定硫酸滴定液浓度 的不确定度 u (C D) 、滴定总氮实际消耗硫酸滴定液 的不确定度 u (V T 4 -V 0) 、稀释硫酸滴定液的不确定 度 u (V D 1 /V D 2) 。 在试验中使用的玻璃仪器均为 A级,因此不能 通过提高仪器的精密度改善结果, 但可采取下述2个措施降低本方法的不确定度。 1) 使用较大规格的移液管。 u(V T 1 / V T 2 ) 与 u(V T 3)较大的原因是 1. 0 mL移液管引入的不确定 度明显大于较大规格的移液管。故在使用本方法测 定样品时,在样品量允许的前提下,通过重新设计试 验步骤,在吸取样品时选用较大规格的移液管,将能 显著降低 u (V T 1 /V T 2) 与 u (V T 3) 。 2) 使用合适的自动化仪器进行样品消化及滴定, 同时规范试验操作,严格控制试验条件,将能有效控 制试验过程中产生的随机误差,从而降低 u (r e p ) 。